تشخیص مولکولی، فناوری و اصل PCR که معمولاً استفاده می شود

PCR، واکنش زنجیره ای پلیمراز است که به افزودن dNTP، Mg2+، عوامل افزایش طول و فاکتورهای تقویت تقویت به سیستم تحت کاتالیز DNA پلیمراز، با استفاده از DNA مادر به عنوان الگو و پرایمرهای خاص به عنوان نقطه شروع گسترش اشاره دارد. از طریق مراحل دناتوراسیون، بازپخت، گسترش و غیره، فرآیند تکثیر در شرایط آزمایشگاهی DNA رشته دختر مکمل DNA الگوی رشته اصلی می تواند به سرعت و به طور خاص هر DNA هدف را در شرایط آزمایشگاهی تقویت کند.

1. Hot Start PCR

زمان شروع تقویت در PCR معمولی قرار دادن دستگاه PCR در دستگاه PCR نیست و سپس برنامه شروع به تقویت می کند.هنگامی که پیکربندی سیستم کامل شد، تقویت شروع می شود که ممکن است باعث تقویت غیر اختصاصی شود و PCR با شروع داغ می تواند این مشکل را حل کند.

HOT start PCR چیست؟پس از آماده شدن سیستم واکنش، اصلاح کننده آنزیم در دمای بالا (معمولاً بالاتر از 90 درجه سانتیگراد) در مرحله گرمایش اولیه واکنش یا مرحله "شروع داغ" آزاد می شود، به طوری که DNA پلیمراز فعال می شود.زمان دقیق فعال سازی و دمای آن به ماهیت DNA پلیمراز و اصلاح کننده شروع داغ بستگی دارد.این روش عمدتاً از اصلاح کننده هایی مانند آنتی بادی ها، لیگاندهای میل ترکیبی یا اصلاح کننده های شیمیایی برای مهار فعالیت DNA پلیمراز استفاده می کند.از آنجایی که فعالیت DNA پلیمراز در دمای اتاق مهار می شود، فناوری شروع گرم سهولت زیادی را برای تهیه سیستم های واکنش PCR متعدد در دمای اتاق بدون به خطر انداختن ویژگی واکنش های PCR فراهم می کند.

2. RT-PCR

RT-PCR (Reverse transcription PCR) یک تکنیک تجربی برای رونویسی معکوس از mRNA به cDNA و استفاده از آن به عنوان یک الگو برای تقویت است.روش آزمایشی به این صورت است که ابتدا RNA کل در بافت ها یا سلول ها استخراج می شود، از Oligo (dT) به عنوان آغازگر استفاده می شود، از رونوشت معکوس برای سنتز cDNA استفاده می شود، و سپس از cDNA به عنوان الگویی برای تکثیر PCR برای به دست آوردن ژن هدف یا تشخیص بیان ژن استفاده می شود.

3. فلورسنت کمی PCR

PCR کمی فلورسنت (PCR کمی در زمان واقعی،RT-qPCR) به روش افزودن گروه های فلورسنت به سیستم واکنش PCR، با استفاده از تجمع سیگنال های فلورسنت برای نظارت بر کل فرآیند PCR در زمان واقعی و در نهایت استفاده از منحنی استاندارد برای تجزیه و تحلیل کمی الگو اشاره دارد.روش‌های qPCR رایج شامل SYBR Green I و TaqMan هستند.

4. Nested PCR

Nested PCR به استفاده از دو سری پرایمر PCR برای دو دور تقویت PCR اشاره دارد و محصول تقویت دور دوم قطعه ژن هدف است.

اگر عدم تطابق جفت اول پرایمرها (پرایمرهای بیرونی) باعث تقویت یک محصول غیر اختصاصی شود، احتمال تشخیص همان ناحیه غیر اختصاصی توسط جفت دوم پرایمرها و ادامه تقویت بسیار کم است، بنابراین با تکثیر توسط جفت دوم پرایمر، ویژگی PCR بهبود یافته است.یکی از مزایای انجام دو دور PCR این است که به تکثیر محصول کافی از DNA اولیه محدود کمک می کند.

5. تاچ داون PCR

Touchdown PCR روشی برای بهبود ویژگی واکنش PCR با تنظیم پارامترهای چرخه PCR است.

در تاچ داون PCR، دمای بازپخت برای چند سیکل اول چند درجه بالاتر از حداکثر دمای بازپخت (Tm) پرایمرها تنظیم می شود.دمای بازپخت بالاتر می تواند به طور موثر تقویت غیر اختصاصی را کاهش دهد، اما در عین حال، دمای بازپخت بالاتر جداسازی پرایمرها و توالی های هدف را تشدید می کند و در نتیجه باعث کاهش بازده PCR می شود.بنابراین، در چند سیکل اول، دمای بازپخت معمولاً به میزان 1 درجه سانتیگراد در هر چرخه کاهش می یابد تا محتوای ژن هدف در سیستم افزایش یابد.هنگامی که دمای آنیل به دمای بهینه کاهش می یابد، دمای آنیل برای چرخه های باقی مانده حفظ می شود.

6. PCR مستقیم

مستقیم PCR به تکثیر DNA هدف مستقیماً از نمونه بدون نیاز به جداسازی و خالص سازی اسید نوکلئیک اشاره دارد.

دو نوع PCR مستقیم وجود دارد:

روش مستقیم: مقدار کمی از نمونه بردارید و آن را مستقیماً به PCR Master Mix برای شناسایی PCR اضافه کنید.

روش کراکینگ: پس از نمونه برداری از نمونه، آن را به لیزات اضافه کنید، برای آزادسازی ژنوم، لیز کنید، مقدار کمی از مایع رویی لیز شده را بردارید و به PCR Master Mix اضافه کنید، شناسایی PCR را انجام دهید.این رویکرد گردش کار آزمایشی را ساده می‌کند، زمان عملی را کاهش می‌دهد و از از دست دادن DNA در طی مراحل تصفیه جلوگیری می‌کند.

7. SOE PCR

پیوند ژن توسط همپوشانی PCR (SOE PCR) از پرایمرهایی با انتهای مکمل استفاده می‌کند تا محصولات PCR زنجیره‌های همپوشانی تشکیل دهند، به طوری که در واکنش تقویت بعدی، از طریق گسترش زنجیره‌های همپوشانی، منابع مختلف تکنیک A که در آن قطعات تقویت‌شده روی هم قرار می‌گیرند. و به هم متصل شدند.این فناوری در حال حاضر دارای دو جهت کاربردی اصلی است: ساخت ژن های همجوشی.جهش مبتنی بر مکان ژن

8. IPCR

PCR معکوس (IPCR) از پرایمرهای مکمل معکوس برای تکثیر قطعات DNA به غیر از دو آغازگر استفاده می کند و توالی های ناشناخته را در دو طرف یک قطعه DNA شناخته شده تقویت می کند.

IPCR در ابتدا برای تعیین توالی نواحی مجاور ناشناخته طراحی شد و بیشتر برای مطالعه توالی های پروموتر ژن استفاده می شود.بازآرایی های کروموزومی انکوژنیک، مانند همجوشی ژن، جابجایی و جابجایی.و ادغام ژن ویروسی نیز امروزه معمولاً مورد استفاده قرار می گیرند.

9. dPCR

دیجیتال PCR (dPCR) تکنیکی برای تعیین کمیت مطلق مولکول های اسید نوکلئیک است.

در حال حاضر سه روش برای تعیین کمیت مولکولهای اسید نوکلئیک وجود دارد.نورسنجی بر اساس جذب مولکول های اسید نوکلئیک است.PCR کمی فلورسنت بلادرنگ (Real Time PCR) بر اساس مقدار Ct است و مقدار Ct به تعداد چرخه مربوط به مقدار فلورسانس قابل تشخیص اشاره دارد.دیجیتال PCR جدیدترین فناوری کمی مبتنی بر روش تک مولکولی PCR برای شمارش کمی اسید نوکلئیک یک روش کمی مطلق است.