استفاده و اقدامات احتیاطی از لوله سانتریفیوژ اولترافیلتراسیون
1) یک لوله اولترافیلتراسیون مناسب انتخاب کنید.توجه داشته باشید که غشاهای UF در سطح تحمل خود در برابر مواد شیمیایی مختلف متفاوت هستند.به طور معمول، لوله های اولترافیلتراسیون با وزن مولکولی 10 کیلو دالتون را می توان با برش وزن مولکولی انتخاب کرد که نباید از 1/3 وزن مولکولی پروتئین مورد نظر، مانند 35 کیلو دالتون، بیشتر باشد.اگر وزن مولکولی پروتئین مورد نظر حدود 10 کیلو دالتون باشد، می توان از یک لوله اولترافیلتراسیون با بریدگی وزن مولکولی 3 کیلو دالتون استفاده کرد.
(2) اولترافیلتراسیون، تازه خریداری شده، خشک است، با آب فوق خالص قبل از استفاده اضافه می شود و آب به طور کامل از غشاء، حمام یخ یا یخچال برای چند دقیقه از قبل سرد شده است.سپس آب ریخته می شود، یعنی مایع پروتئینی، و چه مقدار اضافه می شود، هر کدام که بیشتر از خط سفید بالای لوله نباشد.عملیات سبک است و لوله اولترافیلتراسیون باید قبل از افزودن محلول پروتئین روی یخ از قبل خنک شود.
3) هم جرم و هم مرکز ثقل باید به تعادل برسند.توجه داشته باشید که سرعت چرخش و شتاب آن خیلی سریع نیست، در غیر این صورت به طور مستقیم به غشای اولترافیلتراسیون آسیب می رساند.اولترافیلتراسیون گریز از مرکز آغاز شد (سانتریفیوژ قبل از خنک شدن تا 4 درجه).بعد از اینکه RPM سانتریفیوژهای مختلف به g تبدیل شد، متفاوت بود.شتاب سانتریفیوژ به حداقل تنظیم شد و فشار روی غشاء کاهش یافت.توجه داشته باشید حتما بعد از اینکه سانتریفیوژ به سرعت مقصد رسید سانتریفیوژ را ترک کنید و یا اگر مشکلی دارید برای بار اول نمی توانید از پس آن بر بیایید.جهت غشاء به سمت اسپیندل مطابق دستورالعمل تنظیم شد (مورد سانتریفیوژ زاویه ای غشاء به محور عمود است).در استفاده عملی، سرعت چرخش عمومی کمتر از آنچه در دستورالعمل است، به طوری که عمر لوله سانتریفیوژ را می توان افزایش داد.
3) جرم و مرکز ثقل هر دو باید به تعادل برسند.توجه داشته باشید که سرعت چرخش و شتاب آن خیلی سریع نیست، در غیر این صورت به طور مستقیم به غشای اولترافیلتراسیون آسیب می رساند.اولترافیلتراسیون گریز از مرکز شروع شد (سانتریفیوژ قبل از خنک شدن تا 4 درجه).بعد از اینکه RPM سانتریفیوژهای مختلف به g تبدیل شد، متفاوت بود.شتاب سانتریفیوژ به حداقل تنظیم شد و فشار روی غشاء کاهش یافت.توجه داشته باشید، حتماً بعد از رسیدن سانتریفیوژ به سرعت مقصد، سانتریفیوژ را ترک کنید یا اگر مشکلی دارید، بار اول نمی توانید آن را مدیریت کنید.جهت غشاء به سمت اسپیندل مطابق دستورالعمل تنظیم شد (مورد سانتریفیوژ زاویه ای غشاء به محور عمود است).در استفاده عملی، سرعت چرخش عمومی کمتر از آنچه در دستورالعمل ها آمده است، به طوری که عمر لوله سانتریفیوژ را می توان افزایش داد.
(4) هنگامی که به 1 میلی لیتر باقی مانده تغلیظ شد، 50 لیتر محلول بافر را بردارید، 10 لیتر جریان را اضافه کنید و ببینید آیا رنگ آبی وجود دارد یا خیر، به عنوان قضاوت در مورد اینکه آیا لوله اولترافیلتراسیون پروتئین ندارد.اگر لوله نشتی داشت، لایه بالایی را دوباره بریزید و آن را درون لوله جدیدی بریزید تا اولترافیلتراسیون شروع شود.برای تعیین دقیق اینکه آیا لوله ها از دست رفته اند یا نه، قبل از جریان، 10 دقیقه با 5 میلی گرم BSA سانتریفیوژ کنید، روی چسب پروتئینی یا آزمایش خام برادفورد اجرا کنید و با افزودن محلول پروتئین غلیظ باقیمانده (که روی یخ عمل می کند و از گرم شدن پروتئین ها جلوگیری می کند) ادامه دهید. تمام کنسانتره اضافه شده است.در هنگام سانتریفیوژ کردن، اگر رسوب پروتئین‌ها رخ می‌دهد که منجر به بسته شدن لوله می‌شود، مراقب باشید.در صورت وقوع بارش، تعیین کنید که آیا علت خاص بارش غلظت بیش از حد پروتئین است یا یک بافر نامناسب.اولی را می توان با اولترافیلتراسیون چندین لوله اولترافیلتراسیون به طور همزمان، کاهش غلظت، و دومی با تبادل محلول های بافر مختلف تا زمانی که رسوب پروتئین رخ ندهد، حل می شود.
(4) هنگامی که به 1 میلی لیتر باقی مانده تغلیظ شد، 50 لیتر محلول بافر را بردارید، 10 لیتر جریان را اضافه کنید و ببینید آیا رنگ آبی وجود دارد یا خیر، به عنوان قضاوت در مورد اینکه آیا لوله اولترافیلتراسیون پروتئین ندارد.اگر لوله نشتی داشت، لایه بالایی را دوباره بریزید و آن را درون لوله جدیدی بریزید تا اولترافیلتراسیون شروع شود.برای تعیین دقیق اینکه آیا لوله ها از دست رفته اند یا نه، قبل از جریان، 10 دقیقه با 5 میلی گرم BSA سانتریفیوژ کنید، روی چسب پروتئینی یا آزمایش خام برادفورد اجرا کنید و با افزودن محلول پروتئین غلیظ باقیمانده (که روی یخ عمل می کند و از گرم شدن پروتئین ها جلوگیری می کند) ادامه دهید. تمام کنسانتره اضافه شده است.در هنگام سانتریفیوژ کردن، اگر رسوب پروتئین‌ها رخ می‌دهد که منجر به بسته شدن لوله می‌شود، مراقب باشید.در صورت وقوع بارش، تعیین کنید که آیا علت خاص بارش غلظت بیش از حد پروتئین است یا یک بافر نامناسب.اولی را می توان با اولترافیلتراسیون چندین لوله اولترافیلتراسیون به طور همزمان، کاهش غلظت، و دومی با تبادل محلول های بافر مختلف تا زمانی که رسوب پروتئین رخ ندهد، حل می شود.
(5) چند مرحله اول برای تغلیظ پروتئین استفاده می شود و اگر قرار است بافر تغییر کند، به آرامی بافر جدید (اولترافیلتراسیون از طریق غشای اولترافیلتراسیون 0.22um) را به حدود 1 میلی لیتر پروتئین کل اضافه کنید و مجدداً به مدت 3 میلی لیتر در حدود 1 میلی لیتر تغلیظ کنید. بارهای متوالی، با حجم نهایی غلیظ نهایی بسته به غلظت پروتئین مورد نظر، به طور کلی نه بیش از 500ul، بلکه تا 200ul.در سه نوبت به 1000 × یا بیشتر دست یابید، اساساً به همان میزان تغییر بافر که با حداقل 10 × یا بیشتر غنی سازی حجم در هر بار محاسبه می شود.
(5) چند مرحله اول برای تغلیظ پروتئین استفاده می شود و اگر قرار است بافر تغییر کند، به آرامی بافر جدید (اولترافیلتراسیون از طریق غشای اولترافیلتراسیون 0.22um) را به حدود 1 میلی لیتر پروتئین کل اضافه کنید و مجدداً به مدت 3 میلی لیتر در حدود 1 میلی لیتر تغلیظ کنید. بارهای متوالی، با حجم نهایی غلیظ نهایی بسته به غلظت پروتئین مورد نظر، به طور کلی نه بیش از 500ul، بلکه تا 200ul.در سه نوبت به 1000 × یا بیشتر دست یابید، اساساً به همان میزان تغییر بافر که با حداقل 10 × یا بیشتر غنی سازی حجم در هر بار محاسبه می شود.
زمان ارسال: نوامبر-09-2022